作 者: 李超能
所属类别:学术科研/保健食品
电 话:88211314
关 键 字:多糖 双歧杆菌 促增殖
摘要：目的：探索藻类中药中多糖对双歧杆菌的促增殖作用。方法：在恒温条件下，以时间和多糖浓度为影响因素，了解不同藻类中多糖对双歧杆菌的促增殖作用，对其量效关系进行分析结果：实验结果表明在37℃多糖浓度在0到2％范围内，双歧杆菌数随多糖浓度的增加而上升；多糖浓度继续升高，则反而下降。结论：海藻中多糖在一定浓度下能很好地促双歧杆菌生长。
Effect of Polysaccharide of Algae Acting on Proliferation of Bifidobacteria
Abstract:
Object: To research the effect of polysaccharide of algae which belong to the chinese traditional medicine acting on proliferation of bifidobacteria.
Method: Keep on the temperature. Carry out the experiment with time factor and concentration factor.Analysis the connection of estimate and effect.
Result: The amount of bifidobacteria appears an ascending trend with the concentration 0~2.0%. And appears appears a descendant trend with the concentration higher than 2% under 37℃
Discussion: Polysaccharide of algae can be an efficient proliferative factor to bifidobacteria.
Keywords: Proliferation, Polysaccharide, Bifidobacteria
一、前言
藻类是低等的海洋隐花类植物，包括紫菜、海带、羊栖菜等。其含有多种生命物质，尤其是海藻多糖有调节细胞分裂与分化、调节细胞生长和衰老及维持生命有机体的正常代谢的功效活性。能够起到抗病毒、抗肿瘤、抗辐射、抗突变、抗氧化、增强免疫机能的效果。随着多糖研究的进展，藻类以其很好的药用价值而得到广泛和深入的研究。
双歧杆菌做为人体肠道内占绝对优势，对人体具有许多重要生理功能的有益菌。随着微生态学的迅猛发展，双歧杆菌的临床保健作用逐渐被人们认识和接受，并对其进行了更深入的研究。
研究药用海藻中多糖对双歧杆菌的促增殖作用，验证海藻中多糖对双歧杆菌有显著的增殖作用，可作为双歧因子进一步开发研制，促进微生态学发展。而我们的日常膳食结构中尽可能多调配这类食物，以促进肠道内双歧杆菌的生长，调节肠道菌群结构，使双歧杆菌等有益菌群占优势。
双歧杆菌是人体的生理细菌，为革兰氏阳性细菌，无芽孢，不运动，严格厌氧，形态多变，不同种或同种不同菌龄，不同生长环境而呈现弯曲杆状L或Y形等多种形态而得名，是人体肠道内数量最多饿一种菌。终生存在于人体与人的健康息息相关。
人的生理、免疫、营养、消化、抗肿瘤、抗衰老、药物效能等都离不开人体自身携带的微生物群人体肠道内的双歧杆菌具有有病治病，无病防病和保健的作用，它能形成生理屏障，阻止致病菌的定植和入侵，保护宿主免受致病菌侵害。能改善蛋白质代谢，提供多种B族维生素，能促进钙铁吸收。还能提高免疫力，增强抗肿瘤等多种作用。双歧杆菌的不足意味着人体发生健康危机，需要及时补充。
随着微生态理论体系的建立，使双歧杆菌的临床保健作用逐渐被人们认识和接受。现国内双歧杆菌微生态调节剂所用菌的生产培养原料较贵，如能选择合适剂量的海藻多糖直接调节人体肠道菌，增殖体内双歧杆菌则能有较广的发展前景。
本实验中的海藻多糖为双歧因子。能促进双歧杆菌增殖所必需的无毒物质称为双歧因子，双歧因子有的是含氮多糖或寡糖，有的是粘蛋白或酶类，有的是肽类或核酸成分其来源充足，分布广泛。
二、海藻多糖促双歧杆菌生长实验
（一）实验材料
1．样品
羊栖菜多糖：利用乙醇沉淀法从羊栖菜中提取。
海带多糖：利用乙醇沉淀法从海带中提取。
海藻 为马尾藻科植物海蒿子或羊栖菜的藻体。咸寒，归肝肾经，有消痰软坚，利水消肿之作用。《本草纲目》中记载：海藻，现咸能润下，寒能泄热引水，故能消瘿瘤，结核之坚聚，而除浮肿、脚气、痰气之湿热，使邪气自小便出也。
昆布 为海带科植物海带或翅藻科植物昆布的叶状体。咸寒，归肝肾经，有消痰软坚，利水消肿之作用。《别录》记载昆布，主十二种水肿，瘿瘤聚结气。
本实验中将用羊栖菜和海带
羊栖菜[Sargassum fusiforme (Harv.) Setch]：藻体黄褐色，肥厚多汁，高15~40cm。固着器为是北太平洋西部特有的暖温带植物，属褐藻类马尾藻科。是一种营养丰富的藻类，干品每百克含蛋白质10.6克，糖类47克，灰分18.3克，脂肪1.3克，钙1400毫克，磷100毫克，钾4400毫克，铁5.5毫克，胡萝卜素550毫克；还有多种维生素和微量元素。
海带[Laminaria japonica Aresch]属褐藻门海带科，是一种大型食用海藻，有丰富的营养。每100克海带中含有蛋白质8克， 甘露醇14克，钾4.36克、铁150毫克，超过菠菜，油菜几倍至几十倍。更为突出的是，海带富含微量元素碘，每100克海带含碘高达24000微克。
多糖提取工艺
取海藻置于托盘放入恒温培养箱低温烘干，用电磨机打碎，使之成粉末状。用天平称取海藻粉50g放入500ml锥形瓶中加蒸馏水250ml放置于95℃水浴锅中，并隔10min晃一次，4h后取出，冷却到室温。离心取上清液，在离心管中加无水乙醇，得到沉淀再次离心，取沉淀(多糖)，用蒸馏水冲洗数遍，于37度烘箱中烘干所得沉淀为粗多糖。
2．培养基：MRS肉汤培养基：
蛋白胨10g、肉浸膏10 g、酵母膏5g、葡萄糖20 g、吐温80 1ml、K2HPO42g、醋酸钠5g、柠檬酸铵2g、MgSO4·7H2O 0.2g、MnSO4·4H2O 0.05g、蒸馏水1000ml。pH值6.4。
20％肉汤：蛋白胨1g、肉浸膏1g、蒸馏水1000ml。pH值6.4。
3．菌株：取自丽珠肠乐胶囊（由双歧杆菌制成的干粉胶囊），珠海丽珠医药集团股份有限公司，批号20030404。
4．实验仪器
Nbox Jar 7.0L，法国生物梅里埃公司
S.C.303型隔水式电热恒温培养与试剂
厌氧培养盒GE箱，嘉兴新睦电器厂
除氧剂，法国生物梅里埃公司
LD4－2高速离心机，北京医用离心机厂
754型紫外可见分光光度计，上海第三分析仪器厂
TG328B电光分析天平
THZ－82型恒温振荡器，江苏太仓医疗器械厂
（二）实验方法与结果
1．菌液与溶液制备
菌液制备：无菌条件下，从丽珠肠乐胶囊中取出内容物，溶解于10ml浓度为0.9％的无菌生理盐水，搅拌均匀后用接种针蘸取少许溶液，涂布于无菌MRS固体培养基平板上，37℃下，于厌氧培养盒培养3d。再从平板中挑取色泽淡黄、圆滑突起的单菌落，接入40ml MRS液体培养基，37℃厌氧培养2d。取少量培养液，测得菌液浓度为2.7×108个/ml。使用前稀释至1.0×108个/ml备用。
多糖溶液制备：利用蒽酮硫酸法测得醇沉淀中多糖含量：羊栖菜：25.2％；海带：24.7％；将2种粗多糖分别配制成一定浓度的溶液，并按实验需要稀释为8.0％、4.0％、2.0％、1.0％、0.5％的水溶液，每管各10ml，分别加入浓度为20％的肉汤培养基10ml混匀，同时制备作为对照的10％肉汤，115℃湿热灭菌15min后备用。
附. 蒽酮硫酸法测定多糖含量
原理：糖类遇浓硫酸脱水生成糠醛或其衍生物，可与蒽酮试剂缩合产生有色物质，反应后溶液呈蓝绿色，于620nm处有最大吸收，显色与多糖含量呈线性关系。
标准曲线的制作：分别取0.1g/L的葡聚糖溶液0.05，0.10，0.20，0.30，0.40，0.60，0.80ml，用蒸馏水补到1.00ml；分别加入4.00ml蒽酮试剂，迅速浸入冰水浴中冷却，各管加完一起进入沸水浴中，管口加盖玻璃球，以防蒸发。自水浴重新煮沸起，准确煮沸10分钟取出，用自来水冷却，室温放置10分钟左右，于620nm比色。以同样处理的重蒸馏水为空白，进行比色。以光密度(OD值)为纵坐标，糖的含量微克数为横坐标，得标准曲线。
样品含量测定：取相当于糖浓度50μg/ml左右的样品溶液1.00ml，加入蒽酮试剂，同标准曲线制作之操作，比色测定。根据标准曲线和样品浓度计算含量。
标准曲线的制作
表为标准曲线相应数据
|
|
0 |
1 |
2 |
3 |
4 |
5 |
6 |
7 |
|
含糖量 ug |
0 |
5 |
10 |
20 |
30 |
40 |
60 |
80 |
|
OD值 |
0.000 |
0.031 |
0.058 |
0.112 |
0.204 |
0.285 |
0.394 |
0.526 |
曲线Y=A+BX 得：A= -4.89×10-3 B=6.71X10-3 r=0.998
依数据绘曲线
Y=0.00671-0.00489X；r=0.998
用分析天平取海带多糖0.1213g，溶于100ml蒸馏水中，取1ml进行吸光度测定。得吸光度：0.153，代入标准曲线得多糖29.9ug海带提取物含多糖％＝0.0299×1000/121.3×100%=24.7%
用分析天平取羊栖菜多糖0.2008g，溶于100ml蒸馏水中，取1ml进行吸光度测定。得吸光度：0.254，代入标准曲线得多糖50.6ug
羊栖菜提取物含多糖％＝0.0506×1000/200.8×100%=25.2％
三．促双歧杆菌生长实验
（一）时间因素
取3组浓度为2.0％、1.0％的多糖溶液管与作为对照的10％的肉汤液体管各10ml,加入浓度为107个/ml的双歧杆菌菌液各0.1ml，37℃厌氧培养。12h、24h、48h后，分别取样用无菌生理盐水稀释，接种于MRS琼脂平板上，37℃厌氧培养4d，计算出每ml培养液中所含的活菌数。结果见表1。以双歧杆菌活菌数对数为纵坐标，时间为横坐标，绘得图1。
表1 培养时间对双歧杆菌株的影响 log10n/ml
|
多糖浓度
时间 |
1.0% |
2.0% |
对照 |
|
12h |
7.986 |
8.245 |
6.023 |
|
24h |
8.301 |
8.568 |
6.176 |
|
48h |
8.121 |
8.302 |
6.094 |
图1 培养时间对双歧杆菌的影响
注：图中纵坐标为菌液浓度对数值；横坐标为培养时间 （二） 浓度因素
根据表1选择最佳的多糖溶液培养时间24h。取两组海藻多糖浓度为4.0％、2.0％、1.0％、0.5％、的多糖肉汤溶液管以及作为对照的10％肉汤管各9ml，分别加入浓度为106个/ml的双歧杆菌菌液1ml，37℃厌氧培养24h，取样用无菌生理盐水稀释后，接种于MRS琼脂平板上，37℃厌氧培养4d，计算出每ml培养液中所含的活菌数。表2即为各浓度多糖培养液中双歧杆菌的活菌数。将实验结果换算成以10为底的对数值，进行统计比较，结果见表3。以双歧杆菌活菌数对数为纵坐标，多糖浓度为横坐标，绘得图2。
表2不同浓度海藻多糖对双歧杆菌增殖作用的影响 单位：个/ml
|
多糖来源
多糖浓度 |
羊栖菜 |
海带 |
|
0.0％ |
7.4×107 |
7.4×107 |
|
0.5％ |
8.7×107 |
2.0×108 |
|
1.0％ |
1.0×108 |
3.0×108 |
|
2.0％ |
2.0×108 |
4.2×108 |
|
4.0％ |
1.5×108 |
2.9×108 |
表3 各项增殖菌数的对数值及其统计分析
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多糖来源
多糖浓度 |
羊栖菜 |
海带 |
试验组与空白组方差分析 |
|
0.0％ |
7.869 |
7.869 |
－ |
|
0.5％ |
7.940 |
8.301 |
P<0.05 |
|
1.0％ |
8.000 |
8.477 |
P<0.05 |
|
2.0％ |
8.301 |
8.623 |
P<0.05 |
|
4.0％ |
8.176 |
8.462 |
P<0.05 |
 图2 不同浓度海藻多糖对双歧杆菌增殖作用的影响
注：图中纵坐标为菌液浓度对数值；横坐标为多糖浓度
三、分析与讨论
从表2可以看到，在试验浓度下，各类海藻多糖对双歧杆菌均有显著的促生长作用。加入不同浓度多糖的各试管双歧杆菌活菌数明显高于对照组（P<0.05）。图2显示，多糖在0.5％～2.0％的范围内，随着浓度的增加，双歧杆菌的活菌数呈上升趋势，增长较为平缓，当浓度为2.0％的时候到达顶峰。说明在这一范围内，羊栖菜多糖对双歧杆菌的促生长作用与浓度呈正相关。然而在多糖浓度为4.0％的时候，双歧杆菌活菌数出现下降。推测其原因，随着多糖浓度的增高，培养液渗透压也逐渐增大，使环境变得不利于双歧杆菌生长，从而造成菌数减少。因此，本实验结果显示适合双歧杆菌生长的羊栖菜多糖浓度在2.0％～4.0％之间。在不同的海藻多糖之间，双歧杆菌的活菌数也存在着差异，海带多糖的促生长作用较强，而羊栖菜促生长则相对较弱，与前者相差一倍。在2.0％多糖浓度下37℃培养24h，各类海藻多糖的促生长作用最强，海带多糖培养液可以使双歧杆菌的活菌数达到原来的6倍。
实验结果表明海藻多糖是非常优良的双歧杆菌促生长因子，能有效增加肠道内的双歧杆菌数量。在服用海藻多糖时应控制好多糖的用量或者采用缓释技术，使得多糖在一个合适的浓度到达肠道，并保持一定的时间，对双歧杆菌的生长起到促进作用，促进双歧杆菌在肠道内的增殖和定植，优化肠道的结构，维护机体的生态平衡，达到最佳的保健功效。根据表1，双歧杆菌在厌氧条件下37℃培养24h，活菌数达到高峰，此时是获得双歧杆菌最高生物量的最佳时间，为双歧杆菌为主的微生态活菌制剂生产提供了有用的条件参数。
本实验采用了10％肉汤培养基为基质，使各种营养成分降低到仅能维持备试菌生长的浓度，目的是减少营养成分的影响，更能准确反应添加各类多糖的促进效果。目前增殖肠道内双歧杆菌有两种方法，一是通过摄取含双歧杆菌的食物，补充双歧杆菌的不足。二是服用促双歧杆菌生长的双歧因子，直接扶持、促进肠道中原双歧杆菌的生长、繁殖，优化肠道菌群结构，起调节肠道菌群的作用。但前者由于在储存过程中活菌数不稳定而影响了治疗效果。本研究证实，海藻多糖是一种新的天然双歧因子，它对双歧杆菌促生长实验为海藻类中药的营养保健价值提供了科学的实验依据，也提示我们正确利用野生植物资源。如把海藻这类资源丰富的野生植物改造成营养保健食品，前景是非常广阔的。
主要参考文献：
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