一、增殖细胞核抗原基因反义RNA表达质粒的
构建及对人胃癌细胞的抑瘤效应
戴林 张学庸 惠宏襄 王成济 樊代明
【摘要】 目的 观察增殖细胞核抗原（PCNA）基因反义RNA表达质粒对人胃癌细胞生长特性的影响，探讨其抗肿瘤作用。方法 用DNA重组方法将人PCNA基因反向克隆到真核表达质粒pDOR-neo中，构建成人PCNA基因真核表达质粒pDR-PCNA，用脂质体介导转染人胃癌细胞系SGC-7901。结果 经G418筛选获得转染细胞SGC/PCNA，与亲本细胞相比，其生长速度减慢，RNA、蛋白质的生物合成受到抑制，S期、G2/M期DNA含量降低。结论 PCNA基因反义RNA对胃癌细胞的生长具有明显的抑制作用。
【主题词】 胃肿瘤 细胞株 增殖细胞核抗原 RNA，反义 基因治疗
增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）是DNA聚合酶δ的辅助因子，在DNA复制、细胞增殖及细胞周期调控中发挥重要作用。PCNA在许多肿瘤组织中都有高表达，并随肿瘤浸润深度增加及转移，其表达呈明显上升趋势。Sakakura等用18-mer PCNA反义ODN抑制了多种胃癌细胞系的生长。提示PCNA与肿瘤发生、发展关系密切，有可能成为肿瘤基因治疗的靶点。为研究PCNA基因与胃癌的关系，探索胃癌基因治疗的靶基因，我们构建了人PCNA基因反义RNA真核表达质粒，并观察其对人胃癌细胞的抑瘤效应。
材料与方法
⒈基因与载体：pT7hPCNA质粒由美国冷泉港分子生物学实验室Waga博士惠赠，在其表达载体p30382XT的Xbal、BamHI位点间插有人PCNA基因。真核细胞表达质粒pDOR-neo由英国皇家癌症研究会Morgenstem博士惠赠。
⒉主要试剂：Lipofect amineTM脂质体药盒购自Gibco公司，G418购自Sigma公司，[α-32p]UTP购自北京福瑞公司，限制性内切酶、连接酶购自华美生物技术有限公司。
⒊质粒制备：DNA片段回收、DNA连接、细菌转化及基因鉴定参照《分子克隆实验指南》进行。
⒋DNA转染：用Lipofect AMINETM介导将空载质粒pDOR-neo及重组质粒pDR-PCNA转染至人胃癌细胞SGC-7901（由军事医学科学院毒物药物研究所引入），分别命名为SGC/neo和SGC/PCNA，并以SGC-7901作为阴性对照。转染72小时后，用G418（400μg/ml）筛选3周，挑取单个抗性细胞在G418（100μg/ml）下常规培养扩增。
⒌细胞生长曲线：在24孔培养板中，分别于每孔接种每亳升3×104个细胞，每日取各种克隆细胞株3孔，0.25％胰酶消化计数，连续5天，绘制出生长曲线。
⒍RNA单链探针的制备及RNA斑点杂交：将PCNA基因头尾端克隆至pEG3Z质粒的HindⅢ和BamHI位点间，分别利用SP6、T7启动子体外转录盒（Riboprobe Kit，美国promega公司），及[α-32p]UTP标记出正义和反义PCNA RNA单链探针。提取SGC-7901和经转染72小时后的SGC/PCNA细胞RNA，按常规方法进行RNA斑点杂交。
⒎免疫组织化学染色及图像分析：取经转染72小时的3组细胞爬片，经冷丙酮固定后，进行ABC免疫组化染色，观察PCNA表达的变化，同时进行图像分析。
⒏细胞周期测定：取1×106对数生长期单细胞悬液，0.01 mol/L pH7.4PBS洗涤后，70％乙醇固定，PI（propidium iodide）染色，应用Partec-CAⅡ型流式细胞仪（FCM）检测细胞DNA含量。
⒐透射电镜观察：SGC/PCNA、SGC/neo和SGC-7901 3种细胞各取1×106，经0.01mol/L pH7.4PBS洗涤后，加入6％小牛血清白蛋白，粘合反应30分钟，离心弃上清，25％戊二醛4℃固定24小时，按常规电镜制作技术制备电镜标本，600-800nm的超薄切片收集于带膜的铜网上，经铀、铅电子染色后，行电镜（JEM-2000EX）观察。
结果
⒈PCNA反义RNA表达质粒的构建及鉴定：用BamHI和Xbal酶切质粒pT7hPCNA，得到1.3kb人PCNAcDNA全长序列，将其插入到pUC19质粒BamHI-Xba Ⅰ间，成为pUC-PCNA，再分别用Pstl、EcoRI、Kpn I和Sal I-BamHI进行酶切分析，得到大小不同的片段。这些片段与PCNAcDNA序列一致。回收SalI-BamHI片段并将其反向（定向克隆）插入到pDOR-neo（6.5kb）的BamHI-SalI位点间，经连接、转化和酶切，鉴定筛选出重组质粒（图1），并将其命名为pDR-PCNA。
⒉细胞生长曲线：SGC/PCNA细胞经G418筛选后，其生长速度与亲本细胞SGC-7901相比明显减慢，在培养第5天，细胞生长抑制达59％。而SGC/neo细胞生长速度与亲本细胞相比，无明显改变。
⒊细胞内mRNA水平变化：PCNA正义RNA单链探针检测到SGC/PCNA细胞有较强的杂交信号，而SGC-7901细胞无杂交信号产生。表明pDR-PCNA已整合至SGC-7901细胞染色体中，并有较高浓度的PCNA反义RNA表达。反义PCNA RNA单链探针检测到SGC-7901细胞有强杂交信号，而SGC/PCNA细胞也有杂交信号出现，但较SGC-7901细胞明显减弱，表明SGC/PCNA细胞正义PCNA mRNA的表达被部分抑制。经对杂交斑点薄层扫描（CX-9000薄层扫描仪，日本岛津），SGC/PCNA细胞PCNA mRNA被抑制47.5％。
⒋免疫组化染色：免疫组化染色显示，SGC/PCNA细胞体积缩小，阳性细胞所占比例及染色深度较SGC-7901细胞明显降低，而SGC/neo与SGC-7901大体相同。用图像分析法对每张染片5个高倍视野中124个阳性细胞灰度、面积进行测定，结果显示两组差异有非常显著性（P＜0.0001）。
⒌转染细胞的周期分布：FCM分析显示，SGC/PCNA细胞与SGC-7901相比，G1期细胞增加20.5％，S期和G2/M期细胞分别减少29.8％和21.2％。SGC/neo与SGC-7901细胞相比无明显变化（附表）。
附表 FCM测定细胞周期分布
DNA含量（％）
组别
G0/G1
S
G2＋M
SGC-7901
57.1
32.6
10.4
SGC/neo
48.1
30.8
21.1
SGC/PCNA
68.8
23.0
8.2
⒍转染细胞超微结构变化：透射电镜观察SGC-7901和SGC/neo细胞形态正常，核仁、染色体及细胞器清晰可见，核膜包膜完整。而SGC/PCNA细胞形态出现多种改变，不仅有空泡变性、内质网扩张、线粒体肿胀，而且部分细胞出现核染色质浓集成块，在核膜下边集，呈月牙状。
讨论
胃癌的发生机制十分复杂，不仅涉及多种癌基因、抑癌基因的变化，而且一些细胞因子在胃癌的发生发展中也起到一定的作用。尽管这些基因、细胞因子对细胞的作用方式不同，作用途径和作用部位有别，但最终结果都将导致细胞的恶性增殖。因此，遏制细胞的恶性增殖是肿瘤治疗的基础。
PCNA作为DNA聚合酶δ的辅助因子，不仅在DNA复制中起到关键作用，而且来自细胞内外的增殖信号都须经过PCNA的参与，才能引发DNA的合成。众多研究表明，PCNA在几乎所有肿瘤组织中都有高度表达， 我们免疫组化研究也表明，PCNA在胃癌的阳性表达率为100％，并与胃癌淋巴结转移密切相关。为此，我们选择PCNA作为胃癌基因治疗的靶位，用真核细胞质粒载体表达PCNA反义RNA特异性封闭肿瘤细胞的mRNA，以期控制癌细胞的增殖，达到治疗肿瘤的目的。实验结果表明，当pDR-PCNA转染胃癌细胞后，反义RNA单链探针检测到SGC/PCNA细胞内PCNA正义RNA水平水平降低47.5％；转染细胞的免疫组化染色强度明显降低，阳性细胞所占比例下降；SGC/PCNA生物速度明显减慢，G1期DNA含量增多，而S期、G2/M期含量降低。这些变化主要是由于PCNA被抑制后，细胞内DNA合成减少，致使癌细胞增殖受阻。此外，SGC/PCNA细胞超微结构发生了变化，如空泡变性、内质网扩张、线粒体肿胀等，部分细胞出现胞浆固缩和染色质浓缩边集等改变。这种变化是否与细胞凋亡有关，还有待进一步证实。有关PCNA与凋亡的关系尚未见报道，但这一现象的出现，为我们更深入了解PCNA的作用及细胞调控机制提供了一种参考数据。
上述结果提示，用PCNA基因反义RNA阻断某特定的基因表达，可以抑制SGC/7901胃癌细胞的增殖，改变肿瘤细胞的生物学行为。合理地利用反义技术以改变和逆转肿瘤细胞的恶性表型，是肿瘤基因治疗的一个方向。
二、癌特异性阿霉素免疫脂质体的制备及其特性的研究
摘 要
应用抗人胃癌单克隆抗体Mgb2制备阿霉素免疫脂质体，并对其理化及免疫学特性进行观察。采用逆相蒸发法和修饰抗体插入法并加以改良。125I-MGb2 测得抗体插入率878±58%，抗体修饰度15.1% ，药物包裹率47.6%±8.1%。免疫脂质体经电镜负染观察为大单层脂质体，直径105.6±21.1nm。每个免疫脂质体平均包入5600分子阿霉素，插入48分子MGb2 。间接免疫荧光和ELISA证实抗体活性保持良好。结合实验证明免疫脂质体可特异地结合并将其内容特携带至人胃癌靶细胞。免疫脂质体对人胃癌靶SGC-7901显示选择性杀伤作用，其杀伤力是游离阿霉素的2.2倍，是非特异脂质体的23.1倍，但对正常人胚肺细胞SL7毒性小，结果表明，制备的胃癌特异性免疫脂质体对阿霉素具有较好的导向作用。经过动物实验，该免疫脂质体将可能用于胃癌的导向治疗。
三、Mrp反义RNA对胃癌细胞系SGCA7901化疗药物敏感性的影响
摘 要 目的：本研究应用分子生物学技术，构建mrp反义RNA真核表达载体，转染胃癌细胞系SGC7901，观察mrp反义RNA对化疗药物VCR敏感性的影响以及mrp mRNA表达的变化对GST活性的影响，以进一步明确GST与MRP介导的耐药之间的关系，同时为mrp作为目的基因进行临床肿瘤多药耐药的基因治疗奠定一定的实验基础。
方法：
1．1用BamHI和 Xhol双酶切原始质粒pBMRP释放出—1Kb的mrp cDNA片段，通过基因重组技术将该基因片段插入真核表达载体pcDNA3.1(-)的BamHI和 Xhol酶切位点之间。将重组质粒命名为pcDNA3—AMRP。
2．通过脂质体介导将重组的真核表达载体转染到胃癌细胞系SGC7901细胞中，经G418抗性筛选，获得稳定转染的细胞克隆，并命名为M-SGC7901。
3．应用32P标记mrp单链寡核苷酸探针和核酸打点杂交技术检测M-SGC7901细胞中mrp mRNA表达的变化。
4．通过描绘细胞生长曲线，观察mrp反义RNA对M-SGC7901细胞生长速度的影响。
5．应用MTT检测M-SGC7901细胞对VCR敏感性的变化。
6．应用流式细胞仪观察经VCR处理后M-SGC7901细胞周期的变化。
7．检测M-SGC7901细胞内GST活性的变化。
结果：
①原始质粒pBMRP经BamHI和XhoI双酸切消化释放出一长约1Kb的mrp cDNA片段，5’端为BamHI位点，3’端为XhoI位点，将此片段反向克隆到pcNDA的BamHI和XhoI位点，建成mrp反义RNA真核表达载体pcDNA—AMRP，经BamHI和XhoI酶切鉴定证明构建成功。
②利用lipofectamine将重组质粒pcDNA—AMRP转入SGC7901细胞，经G418抗性筛选后有G418抗性的细胞克隆形成，命名为M-SGC7901。
③打点杂交显示M-SGC7901中有mrp mRNA表达的减少，提示有mrp反义RNA的表达。
④M-SGC7901细胞生长曲线表示mrp反义RNA对M-SGC7901细胞的生长无明显影响。
⑤MTT显示M-SGC7901与其亲本细胞相比对VCR敏感明显增加，其IC50降低64倍（P<0.05）。
⑥流式细胞仪显示经VCR处理后M-SGC7901细胞的生长停滞于G1期，表现为G1期细胞明显增多，S期细胞明显减少（P<0.05）。
⑦M-SGC7901细胞内GST活性变化不明显（P<0.05）。
上述结果提示：
1．在M-SGC7901细胞中mrp反义DNA能有效抑制 mrp mRNA的表达。
2．Mrp mRNA表达的下降并不影响M-SGC7901细胞的生长速度，但显著增加了该细胞系对化疗药物VCR敏感性。
3．Mrp mRNA表达的变化对GST活性无明显影响。
关键词：胃癌 多药耐药 多药耐药相关蛋白 反义核酸 基因治疗
四、反义HSP90 mRNA对消化系肿瘤细胞药物敏感性的影响
1．了解HSP90β在人胃癌细胞中的表达及在人胃癌耐药细胞系中的表达。
2．构建反义HSP90 βmRNA真核表达载体，转染人消化系肿瘤细胞系，以了解反义HSP90βmRNA对肿瘤细胞药物敏感性的影响。
方法：
SABC免疫组化法了解HSP90β在人胃癌细胞中的表达及在人胃癌耐药细胞系中的表达。从原始质粒phHSP90中用EcoRI及BamHI消化下一长约1.0kb，3’端为BamHI,5’端为EcoRI的片段，将此片段反向克隆入pcDNA的BamHI、EcoRI位点，构建反义HSP90βmRNA真核表达载体。Lipofectamine介导基因转染入胃癌细胞系SGC7901，胃癌多药耐药细胞系SGC7901/VCR，人肝癌细胞系HCC7402及食道癌细胞系Ec109，用G418筛选出H-SGC7901，H-SGC7901/VCR，H-HCC7402及H-Ec109抗性克隆。用打点杂交及RNA保护分析法证明基因转染细胞有反义HSP90mRNA表达。Westem blot及/或SABC免疫组化法检验HSP90β、PGP及TOPOⅡ的表达。MTT法测定转染细胞对化疗药物的敏感性，PCM测定转染细胞内ADR的聚集。
结果：
在胃粘膜正常组织，胃炎及癌旁细胞中有少量的HSP90β表达。阳性表达率分别为11.76%、13.04%及11.42%，各组之间无显著差异(P<0.05)。在胃癌组织中HSP90β的阳性信号增强，阳性表达率增高，阳性率为30.00%，显著高于前三组(P<0.05)。其中在高分化胃腺癌中HSP90β的阳性率为15.38%，中分化腺癌中的阳性率为31.25%，低分化腺癌中的阳性率为33.33%，粘液腺癌中的表达率为42.85%。各组HSP90β的阳性表达率有显著差异。(P<0.05)。HSP90β主要分布于胃癌细胞的胞浆中。此外，在胃癌多药耐药细胞系SGC7901/VCR中，HSP90β的表达明显高于其亲本细胞。
从原始质粒phHSP90中消化下一长约1.0kb 3’端为BamHI,5’端为EcoRI的片段，将此片段反向克隆入pcDNA的BamHI、EcoRI位点，构建反义HSP90 mRNA真核表达载体pcDNA-HSP90，经BamHI、EcoRI酶切鉴定证明构建成功。
用Lipofectamine 将重组质粒pcDNA-HSP90转染SGC7901，SGC7901/VCR，HCC7402及Ec109细胞。利用真核表达载体pcDNA中含有的新霉素抗性基因Neo用G418进行抗性筛选。筛选出SGC7901，H-SGC7901/VCR，H-HCC7402及H-Ec109抗性克隆。
打点杂交及RNA保护分析证明pcDNA-HSP90转染细胞后筛选的克隆有反义HSP90 mRNA表达。Westem blot及免疫组化结果证明H-SGC7901，H-SGC7901/VCR，H-HCC7402及H-Ec109的HSP90β蛋白表达降低。HSP90低表达可使细胞生长受到不同程度的抑制。使H-SGC7901/VCR及H-Ec109的S期明显减少。不同细胞系对不同药物的敏感性不同，总体来讲，对各种化疗药物的敏感性依次为SGC7901，HGC7901/VCR，HCC7402及H-Ec109，其中SGC7901，H-SGC7901及HCC7402对各种化疗药物较敏感，SGC7901/VCR，Ec109对各种化疗药物不敏感。耐药细胞SGC7901/VCR与其亲本细胞SGC7901相比，对ADR、VCR、MMC及CTX的耐药指数分别为251898.7,628.14及6.32倍。HSP90β蛋白低表达后对化疗药物的敏感性增高，但对不同细胞系、不同化疗药物，敏感性增高程度不同。H-SGC7901对ADR、VCR、MMC的敏感性较亲本细胞分别增加了10倍；10000倍及24.8倍，对CTX的敏感性无明显改变。SGC7901/VCR对ADR、VCR、MMC及CTX的敏感性较亲本细胞分别增加了3.98倍，6.28 倍及3.15倍及5.01倍。H-HCC7401对ADR及VCR的敏感性较亲本细胞分别增加了47.77倍及10倍。对MMC及CTXA的敏感性无明显改变。H-Ec109对ADR、VCR、CTX的敏感性较亲本细胞分别增加了31622.77,22.44倍及 3.16倍，对MMC的敏感性 无明显改变。转染细胞与ADR作用后的荧光强度较亲本细胞增强，说明细胞内ADR聚集增多。其中H-HCC7402及H-Ec109细胞中ADR聚集更为明显。与MTT法测得H-Ec109及H-HCC7402细胞分别较其亲本细胞对ADR的敏感性明显增高相一致。
免疫组化结果表明，转染反义HSP90 m RNA后，各细胞系PGP表达均降低。说明PGP的表达与HSP90β低调可以使PGP的表达降低。pcDNA-HSP90转染细胞GST活性较其亲本细胞显著降低。H-SGE7901，H-SGC7901/VCR、H-HCC7402及H-Ec109细胞较其亲本细胞的GST活性分别降低了2.241倍，8.942倍，17.951倍及3.801倍(P<0.05)。其中H-HCC7402细胞 GST活性降低最为明显。
从免疫组化结果来看，转染细胞TOPOII表达改变不明显。对转染细胞TOPOII活性的测定也未发现其活性有明显改变。看来HSP90β的低调对TOPOII影响不大。
HSP90β低调使药物敏感性的增高可能机制：（1）PGP表达减低；（2）GST活性减低；（3）促凋亡。
结论：
1．在人胃粘膜正常组织，胃炎及癌旁组织中有少量的HSP90β表达，阳性表达率为11%-13%；在胃癌组织中HSP90β的表达增高增强，阳性表达率为30%。
2．在胃癌多药耐药细胞系SGC7901/VCR中，HSP90β的表达明显高于其亲本细胞。
3．反义HSP90mRNA抑制了HSP90β蛋白的翻译。
4．HSP90β低表达可使细胞生长受到不同程度的抑制。
5．肿瘤HSP90β蛋白低表达后对化疗药物的敏感性增高，但对不同细胞系、不同化疗药物，敏感性增高程度不同。
6．转染反义HSP90mRNA后，各细胞系PGP表达均降低，GST活性降低，TOPOII的活性及表达无明显改变。
关键词 胃癌 HSP90β 多药耐药 反义核酸 药物敏感性 PGP GST TOPOII
HSV-TK基因治疗系统对人胃癌细胞的杀伤作用
摘 要 目的：构建单纯疱疹病毒脱氧胸苷激酶（HSV-TK）基因的重组逆转录病毒真核表达载体，并将其转染胃癌细胞，观察HSV-TK/GCV（丙氧鸟苷）基因治疗系统对胃癌细胞的杀伤作用。方法：用EcoRI和Sall酶切质粒pIC19R/MCI-TK，回收1.7kb的HSV-TK基因片段，将其定向克隆入逆转录病毒载体pDOR-neo的多克隆位点。用L IPOFECTAMINE法将HSV-TK基因转染胃癌细胞系SGC 7901。测定阳性转染细胞（SGC 7901/TK细胞）在体外对GCV的敏感性，并将其接种于裸鼠皮下，观察GCV在体内对胃癌细胞的抑制作用。结果：经酶切鉴定，成功地构建了HSV-TK基因的真核表达载体pDTKZ，并将其转入胃癌细胞。体外实验表明，GCV对SGC 7901/TK细胞有明显的杀伤作用，其作用呈现剂量和时间依赖性特点，且同时表现出对其周期亲代SGC 7901细胞的杀伤效应（旁观者效应）。体内实验表明，GCV可抑制HSV-TK阳性胃癌细胞的生长，使已形成的肿瘤逐渐消失。而GCV对HSV-TK阴性的亲代SGC 7901细胞在体内外均无明显的杀伤和抑瘤作用。结论：结果表明，逆转录病毒载体介导的HSV-TK基因转移胃癌细胞，配合以GCV治疗，是胃癌基因治疗的又一理想途径。
将药物敏感基因（drug sensitivity gene）或者称“自杀”基因（suicide gene）转染肿瘤细胞，使其在肿瘤细胞内特异地表达。当应用相应药物治疗时，其基因产物可将无毒性或无活性的前体药物转变成细胞毒性药物，从而杀伤局部肿瘤细胞，此为肿瘤基因治疗的有效方法之一。为此，我们构建了单纯疱疹病毒的脱氧胸苷激酶（HSV-TK）基因的重组逆录病毒真核表达载体，并转染胃癌细胞，观察HSV-TK/丙氧鸟苷（GCV）基因治疗系统对胃癌细胞的杀伤作用。
材料和方法
材料质粒pIC19R/MCI-TK由美国匹兹堡大学药理教研室Huang L.教授惠赠，内含1.7kb的HSV-TK cDNA；逆转录病毒载体pDOR-neo由生化教研室惠宏襄博士惠赠；LIPOFECTAMINETM Kit购自美国GIBCO-BRL公司；G418、MTT均为Sigma产品；胃癌细胞系SGC 7901由本实验室提供。
质粒重组用限制性内切酶EcoR Ⅰ加Sal Ⅰ消化pIC19R/MCI-TK，经凝胶电泳证实有所需1.7kb的HSV-TK cDNA片段，回收。pDOR-neo分别用BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ和Salt Ⅰ酶切鉴定后，用EcoR Ⅰ加Sal Ⅰ酶切，电泳、回收、取回收的HSV-TK cDNA片段及pDOR-neo，经T4 DNA连接酶连接，转化大肠杆菌HB101，铺板培养，挑选克隆，小量碱裂解法提取重组质粒，酶切鉴定，并命名为pDTKZ。
转染采用LIPOFCTAMINE将pDTKZ转染胃癌细胞系SGC 7901，转染后用G418(800μg/ml)筛选3周，将抗性细胞（即为阳性转染细胞，命名为SGC 7901/TK）在G418（200μg/ml）下常规培养扩增。
细胞总RNA斑点杂交（dot blot）分别提取SGC 7901/TK和SGC 7901细胞总RNA，将两组RCN分别点样至硝酸纤维素膜上，用[α-32P]dATP缺口平移法标记HSV-TK基因双链探针，行细胞总RNA斑点杂交。
SGC 7901/TK细胞对GCV的体外敏感性测定 分别将SGC 7901/TK和SGC 7901细胞接种96孔细胞培养板，并加入GCV使终浓度分别为：100、10、1.0、0.1、0.01μg/ml，每一浓度每种细胞做5个复孔，常规培养72h，MTT法测定杀伤率〔1〕。同法分别接种两种细胞，加入GCV(1.0、0.1μg/ml)，分别于24、48、72、96、120h用MTT法测定杀伤率。
旁观者效应（Bystander Effect）测定
将SGC 7901/TK和SGC 7901细胞按不同比例混合接种，加入GCV使终浓度为10μg/ml，常规培养6d，胎盼兰染色法计数活细胞，并计算杀伤率。
SGC 7901/TK细胞对GCV的体内敏感性测定 分别将SGC 7901/TK和SGC 7901细胞接种于BALB/c裸鼠皮下，一周后测量肿瘤大小，同时腹腔内注射GCV(50mg/kg，每天1次，共14d)，对照组注射生理盐水，定时测量肿瘤大小，记录死亡时间。
结果
质粒鉴定pIC19R/MCI-TK酶切鉴定的结果见图1。图1所示HSV-TK cDNA为1.7kb的片段；逆转录病毒载体pDOR-neo为6.5kb，符合其物理图谱。PDTKZ酶切后，电泳呈两条DNA带，分别为1.7kb与6.5kb左右（图2），表明HSV-TK基因已插入到pDOR-neo载体中。
转染用LIPOFCTAMINE法将pDTKZ转染胃癌细胞，经G418筛选2周，将抗性细胞扩增。而未经转染的细胞在G418作用6d后全部死亡。
核酸杂交细胞总RNA斑点杂交结果见图3。SGC 7901/TK细胞总RNA出现阳性杂交信号，而亲代SGC 7901细胞则无杂交信号。
GCV对SGC 7901/TK的体外杀伤作用结果见图4.5。可见GCV对SGC 7901/TK细胞有明显的杀伤作用，其IC50值72h为2.1μg/ml。而GCV对亲代SGC 7901细胞则无明显毒性（P＜0.01）。
旁观者效应在混合细胞中SGC 7901/TK细胞比例（％）分别为0、10、20、40和80时，GCV对混合细胞的杀伤率（％）依次为：0、38.6、81.9、95.3和98.1。
GCV对SGC 7901/TK的体内抑瘤作用 结果见图6。图6所示GCV在体内对SGC 7901/TK细胞（①组）有明显的生长抑制作用，对亲代SGC 7901细胞（③组）则无明显毒性（P＜0.01）。
讨 论
将外源性目的基因转移到真核细胞内，使其在细胞内获得表达，是进行基因治疗的目的，此过程的关键是构建目的基因的重组真核表达载体。pDOR-neo是一种逆转录病毒载体，它可以整合进入宿主细胞基因组中，表达外源性基因。我们将HSV-TK cDNA从pIC19R/MCI-TK中切下，并定向克隆入pDOR-neo中，成功地构建了HSV-TK基因的重组逆转录病录真核表达载体pDTKZ。经酶切鉴定在pDTKZ转入人胃癌细胞中，经G418筛选3周，其抗性细胞即认为是HSV-TK表达阳性细胞（SGC 7901/TK）。RNA斑点杂交结果也表明，其阳性转染细胞总RNA中，有能与HSV-TK基因双链探针杂交的序列，提示细胞内有HSV-TK的mRNA转录，而亲代SGC 7901细胞总RNA则无阳性杂交信号。说明pDTKZ已被转入胃癌细胞内，并且HSV-TK基因获得了表达。
目前在肿瘤药物敏感基因中，应用最多的是HSV-TK基因〔2〕。我们用自己构建的HSV-TK基因真核表达载体pDTKZ，成功地将HSV-TK基因导入人胃癌细胞中，并获得了表达。当用其特异性底物GCV处理时，发现GCV在体外对SGC 7901细胞有明显的杀伤作用，其杀伤作用呈现剂量依赖性和时间依赖性特点。体内实验也表明，将SGC 7901/TK细胞接种裸鼠皮下，形成肿瘤后给于GCV治疗，可抑制肿瘤生长，使已形成的肿瘤逐渐缩小，最后完全消失。体内外实验结果显示GCV对HSV-TK阴性的亲代SGC 7901细胞无明显毒性，无任何杀伤或抑瘤作用。关于HSV-TK/GCV系统杀伤肿瘤细胞的机理。目前认为，TK是DNA合成补救途径的一种酶，可催化脱氧胸苷（dThd）磷酸化，真核细胞中的细胞TK特异性很强，底物范围很窄，只能催化dThd磷化生成脱氧胸苷酸。而HSV-TK除此之外，还可以催化一些核苷类似物如GCV等磷酸化〔3〕。这些核苷类似物对真核细胞无毒性或无活性，且不能在细胞TK作用下磷酸化，因而对HSV-TK阴性细胞毒性很低或无毒性，但在HSV-TK阳性表达的细胞中，因其可被磷酸化生成对细胞有毒性的产物，因而抑制细胞DNA的合成，使细胞死亡。目前用于HSV-TK基因转移治疗肿瘤的特异性底物有两类，一类是嘌呤核苷类似物（如ACV、GCV等）〔4〕，另一类是嘧啶核苷类似物（如BVDU）〔5〕。这两种核苷类似物被HSV-TK磷酸化后，抑制肿瘤细胞生长的机制不同〔6〕。GCV的磷酸化产物主要是抑制细胞DNA聚合酶的活性，或作为dGTP的竞争性抑制物，掺入到合成的DNA中去，阻断DNA链的延长。BVDU的磷酸化产物则主要是通过强烈地抑制细胞的胸苷酸合成酶，从而抑制DNA的合成。
本实验结果还表明，将表达HSV-TK基因的胃癌细胞暴露于GCV之后，不仅HSV-TK阳性细胞被杀死，而且与其共同培养的HSV-TK阴性细胞也可被杀死。当HSV-TK阳性细胞与阴性细胞比例为1:5时，GCV就可将大部分（81.9％）的混合培养细胞杀死。此现象称之为“旁观者效应”（bystander effect）〔7〕。关于旁观者效应的机制， 一般认为是GCV的磷酸化产物扩散至周围的肿瘤细胞而产生。但Freeman等〔8〕提出，此现象可能与细胞凋亡有关。他们发现HSV-TK阳性细胞在GCV的作用下，出现细胞固缩，核染色质致密，形成“凋亡小体”等细胞凋亡的表型特征，而凋亡小体又可被周围的HSV-TK阴性细胞摄取或细胞间通过缝隙连接进行胞质交换，使HSV-TK阴性细胞死亡。阻断凋亡小体的转移可阻止这种旁观者效应。显然，旁观者效应大大加强了HSV-TK/GCV系统杀伤肿瘤的效果。
总之，HSV-TK/GCV基因治疗系统有其许多特有的优点：如选择性地杀伤基因转染细胞，旁观者效应，低剂量的GCV即可杀伤快速增殖的肿瘤细胞，对相对静止的正常细胞产生毒副作用小等。但也有许多不足：首先，HSV-TK基因不可能100％地转移入所有肿瘤细胞，虽有旁观者效应存在，也不能将所有肿瘤细胞杀死〔9〕。其次，旁观者效应虽加强了GCV杀伤作用，但在体内同时也可杀伤肿瘤周围的正常组织细胞，尤其对增殖分裂相对活跃的胃肠道上皮细胞。故HSV-TK/GCV系统在治疗胃肠道肿瘤中的作用会受到一定的限制，不象在治疗脑肿瘤时有更多的优越性。最后，在体内基因转移方法的选择，转染率的高低、体内各种因素（如免疫因素）的影响等，均可影响HSV-TK/GCV肿瘤基因治疗系统的临床使用。相信随着基因转移方法的不断改进，基因表达与调控基础研究的不断深入，以及基因治疗体内机制的不断澄清，这种方式将可能成为肿瘤基因治疗的有效策略之一。
CD3单克隆抗体活化的杀伤细胞对人胃癌
细胞株MNK45体外杀伤及裸鼠体内
抑制作用的实验研究
白云飞 张学庸 牟震先 吴觉平
摘要 用人的外周血单个核细胞（PBMC）与抗CD3单克隆抗体和基因重组的人IL-2共同培养制备CD3AK细胞（CD3McAb Activated Killer Cells），PBMC与rIL-2共同培养制备LAK细胞，用单纯PBMC作为对照细胞，对这三种细胞的增殖及在体外和裸鼠体内的抗人胃癌细胞株MNK45作用进行了实验研究。体外试验结果表明，CD3AK对MNK45有明显杀伤作用，而LAK细胞杀伤率较低，二者差异有非常显著性意义（P＜0.01）；用MTT法和台盼蓝活细胞计数法测定这三种细胞的增殖能力和细胞数量的增加，表明CD3AK的增殖能力和扩增数量均明显高于LA细胞（P＜0.01）。裸鼠体内试验结果显示，对照组及LAK组全部长出瘤结节
CD3AK组无一例长出皮下结果，且生存明显长于前者。
被动输入淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）在某些肿瘤的生物疗法（Biotherapy）中取得了良好效果。但是，LAK疗法由于其显著的缺点，即治疗所需相当量的效应细胞难以满足和辅以大量IL-2，产生一系列副作用，使其进一步推广应用受到限制。近年来，CD3单克隆抗体激活的杀伤细胞（CD3AK），由于其扩增速度、细胞毒活性及体内抗肿瘤活性显著优于LAK细胞而日益受到重视。本实验研究观察了CD3AK的增殖效应，对胃瘤细胞株MNK45的体外杀伤及裸鼠体内移植性胃癌的抑制作用。
材料与方法
1.靶细胞来源：肿瘤细胞MNK45系人胃低分化腺癌，由西京医院消化内科实验室提供，在含10 ％小牛血清的RPMI-1640完全培养基中37℃、5％CO2条件下培养，活细胞率＞95％。
2.抗体及IL-2的来源：CD3单克隆抗体由第四军医大学免疫教研室提供；基因重组人IL-2由第四军医大学药物研究所提供；3G1/3F8抗体系抗流行性出血热单克隆抗体，第四军医大学流行病学教研室提供，为无关抗体。
3.实验动物：为BALB/C裸鼠，6周龄，由第四军医大学动物实验中心提供并在无菌条件下代养。
4.效应细胞及对照细胞的制备：取健康献血者外周血并抗凝，经比重为1.077的淋巴细胞分离液（Ficoll）分离得到单个核细胞（PBMC）；用完全培养液（含有10％灭活小牛血清、0.01％丙酮酸钠、0.24％ HePes、0.2％ NaHCO3、青霉素100u/ml、链霉素100u/ml）制成1×106/ml细胞悬液，分为四个组培养：第一组加300u/ml的rIL-2制备LAK细胞；第二组加CD3单抗（为1/500稀释度，即CD3抗体腹水原液/效应细胞悬液）。RIL-2 30u/ml以制备CD3AK；第三组只加1/500稀释度的CD3单抗制备ATC Anti-CD3 Activated T Cells）；第四组为不加试剂或只加无关抗体3G1/3F8的PBMC。
5.细胞毒作用的检测：我们用51Cr标记MNK45，采用传统的51Cr4小时释放法检测杀伤作用，设最大释放组（加2v Triton X-100）及自然释放组，设不同效/靶比，在96孔V型塑料板中进行。最后取上清在γ计数仪上测定min-1值（曾用cpm值），并算出特异性杀伤率。
6.细胞扩增检测：
(1)我们采用MTT（四甲基偶氮唑盐）法测定细胞增殖能力：培养的淋巴细胞浓度为1×106/ml、200μl/孔加入平底96孔板，设三个复孔，再加浓度为5mg/ml的MTT，25μl/孔， ％CO2下孵育4小时；1500r/min离心后轻轻吸出150μl/孔上清，再加入150μl/孔的二甲基亚砜，静置10分钟后在酶联检测仪上（570nm）测定吸光度（A，曾称光密度OD）；用每组三个复孔A值的平均值来比较，A值高，则增殖快。
(2)以0.2％台盼蓝活细胞计数法估计细胞数量的增加。
7.CD3AK细胞在裸鼠体内对MNK45的抑制作用的检测：本实验采用Winn氏中和法，将裸鼠随机分为三组，每组4只：第一组为肿瘤细胞对照组；第二组为LAK细胞对照组，LAK：MNK45(106)为20:1，皮下注射；第三组为CD3AK组，方法同LAK组。观察皮下瘤结节生长情况及裸鼠的生存期。
结 果
一、效应细胞的扩增
1.计数法估计效应细胞的数量：结果见表1。CD3AK至第2周增加100倍，而LAK细胞只增加20倍。CD3AK至第3周增加近1000倍，而LAK细胞则无明显增加。经配对t检验，差异有非常显著性意义（P＜0.01）。
表1 效应细胞经培养后的扩增情况
培 养 天 数
组别
4
8
12
16
20
CD3AK
3±0.25
40±2.03
102±3.57
425±5.28
987±7.25
LAK
1±0.24
10±1.93
20±4.12
23±3.43
26±6.23
注：n＝10，P＜0.01。表内数据为开始培养时细胞数的倍数
2.MTT法估计效应细胞增殖能力：由表2可见，CD3AK在第一周增殖能力最强，第二、三周仍维持其高水平的增殖能力；而LAK细胞在第一周时最高，第二周便降得很低，至第三周时几乎等于零。经配对t检验，二者差异有显著性意义（P＜0.01）。
表2 MTT法在各周测的A值
周次
组别
1
2
3
4
LAK
0.56±0.25
0.40±0.21
0.23± 0.13
0.03±0.01
CD3AK
1.21±0.24
1.04±0.24
0.86±0.16
0.65±0.12
注：n＝10，P＜0.01
二、CD3AK抗胃癌细胞株MNK45作用的检测
1.CD3AK体外杀伤MNK45的作用：我们选了7位健康献血者，采其外周血。每个献血者的血分为4份，分别制备CD3AK、LAK、ATC 及PBMC＋无关抗体3G1/3F8，后者作为对照，用4小时51Cr释放法测定其对MNK45的杀伤活性，结果用配对t检验统计处理。CD3AK与LAK之间差异有显著性意义（P＜0.01）；ATC及3G1/3F8＋PBMC基本无效（表3）。
2.裸鼠体内试验：
(1)皮下瘤结节生长情况：肿瘤细胞对照组4只裸鼠于皮下接种癌细胞后第1周，皮下均长出直径为0.5cm左右的瘤结节，至第4周，直径平均长至2.5cm左
表3各种效应细胞对人胃癌细胞MNK45的杀伤作用（x±s）
效应细胞 靶细胞
组别
10:1
20:1
40:1
CD3AK
37.97±1.95
47.97±2.05
56.30±2.34
LAK
9.58±2.05
15.85±1.25
33.32±2.00
ATC
2.34±1.25
5.67±2.12
12.78±2.51
PBMC±3G1/3F8
0.63±0.22
0.95±0.34
3.25±1.01
右，表面高低不平；LAK细胞对照组4只全部长出肿瘤结节，肿瘤生长情况基本同肿瘤细胞对照组；CD3AK细胞组，至第5周仍无一只生长肿瘤。
(2)裸鼠生存期观察：肿瘤细胞和LAK细胞对照组至第33天已死亡7只，至第40天8只全部死亡，而CD3AK组在第55天时4只仍全部健康生存。
讨 论
IL-2/LAK在肿瘤的过继免疫治疗中已获得一定成功，TIL、A-LAK及NK细胞也已用于某些肿瘤病人的治疗，但其共同的缺点是：没有足够量的效应细胞以及加用大量rIL-2所带来的严重副作用。近年来CD3单抗诱导的杀伤细胞CD3AK的出现，为解决上述问题提供了有效的方法。文献报道及本研究结果均表明，CD3AK不仅对肿瘤细胞有很高的细胞毒活性，对外源性IL-2依赖性小，而且能迅速大量扩增，可长期培养且维持其活性。
CD3AK杀伤肿瘤及增殖的机理可能有以下几点：①CD3单抗识别T细胞表面的TCR/CD3复合体而引起细胞因子的产生，如TNF、IFN-r等，细胞因子有杀伤肿瘤的作用。②通过产生内源性IL-2、IL-4而起作用。③使CD3AK的IL-2R(IL-2受体)表达增加，对IL-2的反应增强，从而使细胞分裂增殖及细胞毒活性增强。因此，CD3AK在体内、外杀伤肿瘤时，对外源性IL-2的需要量少。
胃癌对IL-2LAK疗法不敏感，且CD3AK对胃癌的治疗还未见报道。本研究结果表明，少量血及低浓度rIL-2制备的CD3AK细胞，在体外对胃癌有较强杀伤作用，并能有效地抑制裸鼠体内MNK45的生长及显著地延长裸鼠生存期，而LAK细胞则无明显效果。因此我们认为，CD3AK可望解决胃癌的继承性免疫治疗中效应细胞量不足、效果差及需大量rIL-2的问题，有很大的实用价值。
131I-花生凝集素对裸鼠载人胃癌的靶向定位和治疗作用
1甘润良 2薛 琼 2江贤鹏 1李一琴 1王宗保 1许金华
1湖南衡阳医学院肿瘤研究所 421001 2上海医科大学中山医院
本文根据受体-配基特异性亲合理论，报道以花生凝集素PNA为载体与131I结合物对祼鼠载人胃癌进行靶向定位和治疗的实验研究结果。
1 材料和方法
1.1 核素标记凝集素
1.2 祼鼠人胃癌模型
1.3 组织分布测定
接种人胃癌移植瘤的祼鼠32只，动物随机分为两组。实验组腹腔注射131I-PNA标记物，对照组腹腔注射Na 131I，放射剂量均为3.7 MBq (100μ Ci)。在给药后1，3，5，7天分批处死动物，每批实验组处死5只，对照组处死3只。取各主要脏器和移植瘤，称重，计数以测定其放射性，并计算靶（T，肿瘤）与非靶（NT，对照部位）摄取放射性的比值（T/NT）。
1.4 放射性核素显像
荷瘤祼鼠5只，随机取出3只，腹腔注射131I-PNA标记物11.1MBq；另外2只注射同样剂量的Na 131I。在注射后24，48，72，120小时进行放射性核素断层显像（ECT，Dgema-500）。
1.5 荷瘤祼鼠体内治疗研究
1.5.1 动物分组及给药方法：采用单次较大剂量治疗。将荷瘤祼鼠随机分为五组，每组5只。A组为实验治疗组，腹腔注射131I-PNA标记物18.5 MBq/100μl。B、C、D三组为治疗对照组，B组腹腔内注射131I-NMIgG标记物18.5 MBq/100μl，C组腹腔内注射未标记PNA 100μg/100μl，D组腹腔内注射单纯Na 131I18.5 MBq/100μl。E组为非治疗对照组，腹腔内注射生理盐水100μl。
1.5.2 肿瘤抑制效应的观察：①肿瘤抑制率：采用双盲法，在治疗前后每周定时测量肿瘤的最长径（a）和最短径（b），按照v=0.4×ab2的公式计算肿瘤体积（cm3）。并按下列公式计算肿瘤抑制率（IR），数据比较采用t检验。②生存期：接受治疗当天自然死亡之日的天数。
（非治疗组-治疗组）平均肿瘤体积
非治疗组平均肿瘤体积
1.5.3 辐射损伤（毒性）的检测：①组织病理学检查：动物6只，分别于接受131I-PNA后第7天、28天和56天各处死2只；留作长期观察的带瘤裸鼠待实验动物死亡或涉死状态进处死。分离肿瘤及祼鼠器官组织，称重后用10%福尔马林溶液固定，作常规病理检查。②定期测理祼鼠体重；以末体重/初体重（FBW/IBW）作评价。当FBW/IBW>0.80判断无毒性，FBW/IBW<0.80判断有毒性反应。③观察治疗前后白细胞计数的变化：治疗前和治疗后每周从尾部采血作白细胞计数，判断辐射对宿主造血功能的影响。
2 结果
2.1 放射标记物的组织分布
注射131I-PNA后，随着时间的推移，放射标记物131I-PNA能够选择性地聚积在肿瘤组织。瘤/血比值由第1天的3.28增至第7天的7.35,瘤/胃比值由0.87增加为4.21。腹腔注入 131I-PNA标记物后第1天肾和肺航船强度最高，T/NT比值分别为0.24和0.52，而后迅速增至第7天的2.70和3.09。体内分布试验结果显示，第5天以后各组织T/NT比值均高于2.0，其中瘤/血、瘤/脑、瘤/肝，瘤/肌肉比值分别是5.87，6.45，4.62和4.32。而对照组Na 131I 在荷瘤祼鼠体内基本上保持全身性均匀分布，与131I-PNA对肿瘤组织的靶向定位作用差异明非常显著性(P<0.01)。
2.2 肿瘤ECT显像
注射131I-PNA 48小时可见肿瘤显像，第72小时本底减退，肿瘤清晰，部位和大小与实际相符。接受Na 131I荷瘤动物未见肿瘤显像。
2.3 不同治疗组肿瘤的生长抑制情况
2.3.1 肿瘤生长速度：治疗前各组平均肿瘤体积为0.35cm×0.35 cm×0.35cm。第1周内，各组肿瘤体积无明显差异；治疗第2周后，A、B、C三组肿瘤生长开始减慢，说胆肿瘤受到抑制；第4周时，131I-PNA组的瘤体明显小于非治疗对照组（P<0.001），131I-NMIgG组也小于非治疗对照组(P<0.01)，另两组与非治疗对照组相比，虽有缩小，但其差异无显著性 (P>0.05)。
2.3.2 肿瘤抑制率：131I-PNA对肿瘤的生长有明显抑制作用，治疗后第4周肿瘤平均抑制率为73.2%，而131I-NMIgG、PNA和Na 131I对肿瘤的抑制率分别为33.8%、27.4%和7.0% 。经统计学处理，131I-PNA组肿瘤抑制与其他组差异有非常显著性(P<0.01)。
2.4 不同治疗对荷瘤鼠生存期的影响
131I-PNA组小鼠的生长期明显长于对照治疗组和非治疗对照组。各组的中位生存期（X±s，n=5）分别131I-PNA组145±19.9天，131I-NMIgG组93±1.78天，未标记PNA组85±25.1天，单纯Na 131I组72±25.2天，非治疗对照组79±17.5天。
2.5 治疗后组织病理学检查
取接受131I-PNA治疗后第7天祼鼠的肿瘤组织，其组织病理学检查显示肿瘤细胞核固缩、核结构不清、核碎裂，部分区域肿瘤组织全部坏死、溶解。治疗后28天病理检查，上述病变仍明显存在，56天可见肿瘤间制裁纤维组织增生和钙盐沉着现象，部分荷瘤鼠的肿瘤表面可见溃疡和结痂。在实验治疗期间对处死的祼鼠检查心肺、肝、肾、脾脏等，除肝、肾有轻度细胞肿胀外，其它脏器无明显辐射损伤。
2.6 标记物的毒性评价
2.6.1 小鼠白细胞计数：以131I-PNA治疗后第1、4、8周检测外周血白细胞数，各组差异均无显著性（P>0.05），提示宿主造血功能未受辐射影响而抑制。
2.6.2 体重测量：131I-PNA组在治疗期间FBW/IBW>0.80，说明所采用的剂量无毒性反应。
3 讨论
本实验利用配基-受体的特异性亲合作用进行肿瘤导向研究，将放射性131碘标记配基PNA，在注射标记物后不同时间进行放射性核素断层显像，显示荷瘤动物肿瘤部位有明显的放射性积聚。标记配基与肿瘤组织相应受体的特异体结合是肿瘤（靶器官）显像的基础，组织分布测定发现注射131I-PNA后第5天T/NT比值均高于2.0，其中瘤/血、瘤/肝，瘤/肌肉比值分别达5.87，4.62，6.45和4.32。在体内分布试验中，配基PNA进入肿瘤组织的过程与单克隆抗体等大分子物质相似，是一个比较缓慢的被动过程，一旦与肿瘤细胞结合，配基即可较长时间停留在肿瘤组织内，而其它组织内的放射性配基则很快在体内转运或排泄，逐渐呈现选择性分布效应。
凝集素（Lectins）是一类双价或多价的，能与细胞表面糖基专一性结合的蛋白质。体外实验证明，花生凝集素（PNA）对某些癌组织具有亲合性，并可抑制癌细胞的增殖。亲合组织化学研究表明，PNA与胃癌细胞有较强的亲合力，PNA受体在胃癌组织中有过量表达。观察131I-PNA标记物在荷人胃癌祼鼠体内的组织分布，结果显示肿瘤组织有明显的放射性浓集，并可使肿瘤部位显像，这为探索肿瘤靶向治疗的载体提供了新的线索。本实验利用131I标记的PNA对祼鼠载人胃癌进行实验性治疗，结果显示131I-PNA对肿瘤有一定的抑制作用。应用18.5MBq/鼠疗效最显著表现在治疗后第4周，肿瘤抑制率可达73.2%；并可延长荷瘤宿主的生存期。这提示131I-PNA具有较好的肿瘤靶向定位和治疗作用。
（致谢：本实验的部分工作在上海医科大学肝癌研究所完成，承蒙湯钊猷教授和刘康达教授指导。）
生物制剂在消化道肿瘤治疗中的应用
山东省千佛山医院（250014） 刘昌俊综述
尽管目前5-FU仍为治疗消化道肿瘤的主要细胞毒药物，但有效率仅15%-20%，缓解期和病人的生存期较短。10余年前所研究的5-FU、甲酰四氢叶酸（LV）方案有效率明显提高，但远期效果仍不尽人意。近年来采用5-FU、LV、IFN（或IL-2）方案治疗消化道肿瘤取得了较好的效果。治疗肿瘤的生物制剂种类繁多，现将近年来常用的IFN、IL-2和OK-432等生物制剂在消化道肿瘤的应用综述如下。
一、结直肠癌
未经治疗的晚期结直肠癌（CRC）预后很差，自然生存期为10个月，采用较多的是5-FU、LV、IFN免疫化疗方案。Buter等采用的方法为口服LV 200mg/m2，每天3次，连服3天；第2-3天静脉推注5-FU 240mg/m2；第1-3天皮下注射IFN-α10×106u，连用4周。共治疗50例晚期CRC，结果CR6%，PR52%，CR+PR为58%，中位缓解期9.4(8.4-10.3)个月，全组中位生存期16.6(10.3-22.8)个月。Grem等静脉滴注高剂量LV 500 mg/m2，30分钟输入，第2-6天；静脉推注5-FU 370 mg/m2，第2-6天；皮下注射IFN-α5×106u/m2，第2-6天；3周重复，共治疗44例晚期CRC，CR7%，PR47%，CR+PR为54%。采用双月高剂量持续48小时静脉滴注5-FU 1.5-2.0 g/m2 ，连用2天；30分钟静脉滴注LV 500 mg/m2 ，连用2天；皮下注射低剂量IFN 3×106u，每周3次。共治疗50例CRC，CR2%，PR42%，CR+PR 为44%，稳定 (SD)46%，恶化 (PD)10%，有效者中位缓解期12个月，SD为8个月；PD病人的中位生存期为9个月，有效者为25个月。据报道，每天皮下注射低剂量IL-23×106u，连续6天，治疗组联合每天口服褪黑色素(melatonin) 40mg，对照组仅用支持疗法，随机对照治疗50例晚期转移性CRC，结果PR12%，对照组无一例肿瘤自然缩小，治疗组1年生存率30%，对照组为12% (P<0.05)。Beerblock和Mark等应用5-FU、LV、IFN或IL-2方案治疗晚期CRC，也取得了较好的效果。也有资料证实，尽管所用治疗方案基本相同，但未能取得较好的效果，说明IFN 不能提高5-FU、LV 方案的疗效。有人应用IFN和单克隆抗体治疗14例晚期转移的CRC，结果无客观疗效。应用IL-2、IFN、5-FU方案或IL-2加单克隆抗体治疗晚期CRC，结果PR14%，SD56%，PR病人的中位生存期为15个月，疗效不优于5-FU、LV方案。几项对照研究证明，晚期CRC术后加服左旋咪唑，结果对C期病人有明显的抗复发作用，对B期无明显效果。有人对照观察43例姑息性术后CRC加用IFN组，尽管能提高机体非特异性免疫功能，但并无抗复发和延长病人生存期的作用。
二、胃癌
Pazdurky采用静脉滴注5-FU每周750mg/m2 ，皮下注射IFN-α-2a 9×106u每周3次，连用7周，治疗44例晚期转移胃癌，CR2%，PR21%，CR+PR为23%，中位缓解期3个月，中位生存期15个月，效果不优于5-FU、LV方案。Machara等将浆膜淁润的36例胃癌根治术后病人随机分为化疗组和化疗加皮下注射OK-432（免疫化疗）组，结果后乾的术后4年生存率(66.7%)明显高于前者(33.3%)。一组研究报道，将970例胃癌术后病人分为根治术组(611例)和姑息术组（189例），各线随机分为术后加口服OK-432组，皮下注射OK-432组和安慰剂组，结果根治术组中的口服OK-432组5年生存率明显高于另外两组(75.2%对65.2%和68.9%，P<0.05)，姑息性术后3组间无明显差异。Pokin等的I期研究，将138例IV期胃癌术后病人分为单纯手术组和OK-432加MFC化疗华组，结果后者术后5年生存率明显高于前者(44.6%对23.4%，P<0.05)；II期研究将170例III期胃癌术后病人分为免疫化疗组、化疗组和单纯手术组，结果免疫化疗组术后5年生存率也明显高于其它两组 (45.3%对29.8%和24.4%)。腹腔内注入OK-432治疗182例胃肠道进展期肿瘤合并腹水的病人，结果112例(61.5%)腹水消失或明显减少，腹水中癌细胞阳性者有效率明显高于阴性者(80%对24.6%，P<0.001)。一组随机对照观察化疗和化疗加皮下注射OK-432治疗胃癌腹膜转移，结果两组间病人的生存期无明显差异。OK-432是一种生物反应答剂，腹腔注射能诱导大量中性粒细胞渗入腹腔中并被激活，通过增加CD11b/CD18分子的表达，促进其对瘤细胞的粘附，终至破坏，渗出的淋巴细胞和巨噬细胞参与后期对瘤细胞的破坏。体内外试验证明，OK-432和单克隆抗体合用具有显著的生长抑制作用。
三、食管癌
晚期食管癌放疗和手术的1年存活率仅15%-20%，80%的病人死于转移。联合化疗可提高有效率(30%-50%)，但远期疗效很差。Barbara等静脉滴注LV 500mg/m2 ，第1-2天；静脉推注5-FU 370 mg/m2, 第2-6天；顺氯氨铂(CP)40mg/m2 ，第6天；皮下注射IFN-α-2a 5×106u /m2 ，第1-7天；治疗11例晚期食管癌。结果9例手术切除，术后4例仍存活，2例已存活27个月。另有报道，静脉滴注5-FU 750mg/m2 ，第1-5天；CP 100 mg/m2 ，第1天；皮下注射IFN-α-2b 10×106u，每周3次；治疗23例晚期食管癌，结果CR4%，PR61%，CR+PR为65% (15/23例)，中位缓解期超过2个月，全组中位生存期8.6个月，治疗后1年生存率40%，2年为30%。II期临床试验证明，5-FU、IFN方案治疗晚期食管癌的有效率为单用5-FU的2倍。
四、5-FU、LV、IFN方案的毒副反应
常见的毒副反应依次为粘膜炎(45%-65%)、恶心、呕吐(40%-50%)、腹泻(30%-40%)和白细胞降低(30%)等。按WHO毒性反应分级，0-1级不足30%，2级为40%，3-4级30% ，后者往往需减量或停止治疗，也有存亡于3-4级毒性的病例。
五、IFN的作用及其机理
已知IFN、LV和MTX是5-FU的主要生物化学调节剂，能增强5-FU的抗癌效果。药物动力学证实：①5-FU具有时间和浓度依赖性抗癌活性，而IFN能提高5-FU在血浆中的水平，并能降低其清除率，无疑IFN能增强5-FU的抗癌作用；②IFN抑制二氢嘧啶脱氢酶和5-FU的分解代谢，活化嘧啶核苷酸化酶，增加5-FU同脱氧嘧啶代谢的交换。动物实验证明：①IFN对HLA=DR的表达较对照组显著增加(P=0.003)，外周血单核细胞FC-R 数目增加；②氟铁龙(5’-DRuR)与IL-2合用，能显著延长荷瘤(Colon 26)小鼠的生存期，局部肿瘤缩小，肺转移受抑制，组织学见到肿瘤细胞退化和坏死，伴有显著单核细胞浸润。实验证明，IFN能显著增加5-FU对DNA链的损伤。
六、结语
HDPVI (5-FU、LV、IFN或IL-2) 是目前治疗消化道肿瘤尤其是晚期结直肠癌的有效框架性治疗方案。高剂量LV和IFN对5-FU的增效作用未必优于低剂量。OK-432是消化道肿瘤术后辅助治疗的有效生物反应应答剂。关于5-FU、LV、IFN方案的用药剂量、方法和确切疗效有待深入研究。
胃癌细胞凋亡与胃癌治疗新策略
广东惠州市中心人民医院（惠州516001）许岸高综述
广东第一军医大学附属南方医院 沈剑刚审校
摘要 从癌前病变、早期胃癌到进展期胃癌，细胞凋亡受抑。诱导胃癌细胞凋亡的研究报道日益增多。本文综述近年有关胃癌细胞凋亡的研究以及从凋亡机制出发导求新的治疗策略。
关键词 胃癌 细胞凋亡
既往的肿瘤发生机制研究多注意细胞的增生异常。晚近的资料表明，细胞凋 亡受抑作为细胞增殖紊乱的对应面，在肿瘤的发生、消退和转归方面均起相当重要的作用。近年来，有关胃癌与细胞凋亡的关系以及从诱导细胞凋亡的机制出发研究新的抗癌方法的报道日益增多，本文就胃癌细胞凋亡与诱导凋亡治疗综述如下。
一、胃癌与细胞凋亡
胃癌既是细胞增殖和分化异常的疾病，也是细胞凋亡异常的疾病。Ishida等[1]采用TdT介导duTP末端平移标记法检测到胃癌存在细胞凋亡现象，并认为细胞闻过则喜亡在胃粘膜发生肠上皮化生等病变中起决定作用，参与胃癌的形成。胃癌的凋亡拽数明显低于慢性胃炎、胃溃疡和肠上皮化生。Gregory等[2]的研究亦证实，胃癌存在细胞凋亡明显受阻现象，认为恶性肿瘤证实，胃癌存在细胞凋亡明显受阻现象，认为恶性肿瘤细胞丧失了自发性凋亡的能力，是肿瘤无限制生长的重要原因之一，而并非完全是生长增殖过快所致。细胞的凋亡异常不写胃癌的许多生物学行为密切相关。Kasagi等[3]研究了不同分化程度的胃癌细胞凋亡指数，发现高分化者凋亡指数明显高于低分化者，显示分化差的胃癌对细胞凋亡存在逃避机制。细胞凋亡高度受抑的胃癌进展快，容易发生转移。Peteer等[5]也证实，分化程度差、预后不良的扩散型胃癌与分化程度较高、预后较好的肠型胃癌比较，细胞凋亡受抑更加显著。该研究还证实了两型胃癌存在着不同细胞凋亡调控基因表达，提示不同病理类型的胃癌存在着不同的凋亡机制。
有研究发现，在肿瘤的发展中，细胞凋亡可能与血管生成有关。Lu等[5]用APOP Tag仪及抗-CD34单克隆抗体测定了101例胃癌病人的凋亡指数与肿瘤内微血管密度，发现两者呈负相关（r=-0.4066，P<0.001），证明胃癌细胞凋亡率受新生微血管范围的显著影响。
总之，在胃粘膜轻度不典型增生、重度不典型增生、早期胃癌到进展期胃癌的发展中，细胞凋亡逐渐受到抑制。胃粘膜病变细胞凋亡减少，生存期延长，细胞大量堆积是胃癌发生、浸润及转移的病量基础。凋亡受抑愈强烈，预后愈差，凋亡指数是判断胃癌预后的重要指标之一[6]。
二、诱导细胞凋亡与胃癌治疗
细胞凋亡是一个非常复杂的生理和病理过程，是正常或病变细胞主动激发的一种“自杀”机制。有关细胞凋亡的研究使人们意识到，应以诱导细胞凋亡为新的目标来寻找治疗肿瘤的新途径，有效的抗肿瘤治疗是诱发肿瘤细胞凋亡，而不是抑制肿瘤细胞增殖或使用毒性药物来杀死肿瘤细胞，因为在杀死肿瘤细胞的同时，肯定也能不同程度地杀伤正常细胞。近年来的研究表明，许多抗肿瘤药物均可诱导肿瘤细胞凋亡。紫杉醇是一种有效的治疗肺癌、乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤和前列腺癌的药物。最近发现，紫杉醇（临床上病人体内能获得的药物浓度）对NuGc-3和Sc-MI人胃癌细胞株有很好的诱导凋亡作用，能阻止G2-M期胃癌细胞在凋亡前的修复，对G0和G1期的胃癌细胞也有细胞毒作用，其生长抑制剂量为0.01μmol/L，提示紫杉醇可用于胃癌的化疗[8]。Yamamoto等[9]应用转化生长因子β1对12株胃肠道癌细胞株进行诱导凋亡实验，发现仅3株癌细胞发生凋亡，认为细胞凋亡实验可用于筛选化疗药物。
在目前的抗癌药物中，无论是细胞周期特异性药物还是细胞周期非特异性药物，对癌细胞的杀伤作用都服从一级动力学原理即只能按比例而不能全部杀伤肿瘤细胞。因此，寻求高效诱导细胞凋亡的药物杀灭这些残存的癌细胞具有非常重要的意义。一般认为不同的抗肿瘤药物诱导细胞凋亡有不同的细胞周期时相特异性。不同作用时诱导凋亡药物联合应用，有助于提高药物对癌细胞凋亡的诱导率，使之更有利于抗肿瘤治疗。目前认为许多因素如高温、射线、非甾体类消炎药、细胞因子等均能不同程度诱导胃癌细胞凋亡。Vollmers 等[10]研究了胃癌细胞SC-1单克隆抗体的抗癌作用，经超策结构观察发现，SC-1单抗对胃癌细胞株祼鼠接种后的胃癌有明显抑制作用，而这种作用完全是通过诱导胃癌细胞凋亡来实现的。三氧化二砷能者多对急性早幼粒细胞白血病有较满意的疗效，深入的研究发现，三氧化二砷是通过下调肿瘤细胞的bcl-2基因表达、诱导细胞凋亡来达到治疗目的的[11]。随后的实验表明，三氧化二砷也能有效地抑制胃癌细胞株MKN45和SGC7901的生长，并证实这种作用也是通过诱发癌细胞凋亡来完成的，并且这种作用承受药物浓度的增加和作用时间的延长而加强。Xu等[12]的研究证实，中药制剂大黄蛰虫丸化裁方的抗胃癌作用与诱导胃癌细胞凋亡有关，提示从细胞凋亡的机制出发，寻求新的抗癌中药制剂是值得深入研究的。
药物诱导细胞凋亡的过程可分为3个阶段：首先，药物作用于靶细胞的特异分子DNA、RNA或微管等，导致靶细胞的机能障碍；继而靶细胞通过某一机制来辨认和评价这种分子损全国各地，并将损伤信号送达凋亡调控点；最后靶细胞对损伤信号作出反应，直至进入凋亡。不同的诱导凋亡因子有不同的靶分子和作用点，选择特异性高的肿瘤细胞凋亡诱导剂，并将不同靶点的药物有机地结合起来，将有可能进一步提高恶性肿瘤的疗效。
三、展望
通过对肿瘤细胞凋亡机制的深入研究，开发新的抗肿瘤药物和途径，将有可能对肿瘤的治疗产生深刻的影响。在我国，从细胞凋亡的机制出发，开发新的抗癌中药制剂有非常深远的意义和广泛的应用价值。
局部手术在早期胃癌治疗中的应用
山东省肿瘤防治研究院（250117） 郭洪亮综述 徐忠法审校
一、早期胃癌相关概念
关于早期胃癌的概念与定义目前已无争议，主要根据肿瘤浸润深度，限于粘膜及粘膜下层未达肌层者，无论肿瘤面积大小、有无淋巴结转移，均称为早期胃癌。早期胃癌又分为粘膜癌（M-carcinoma, MC）及粘膜下癌(SM-carcinoma, SM)。如早期胃癌限于粘膜内为粘膜癌。早期胃癌又分为小胃癌及微小胃癌，病变最大直径小于1cm的早期胃癌为小胃癌，最大直径小于0.5cm者为微小胃癌。术前准确诊断粘膜、粘膜下癌对选择恰当术式死至关重要。根据日本胃癌研究总则，早期胃癌内镜下分型为：隆起型（Ⅰ型）、浅表隆起型（Ⅱa型）、浅表平坦型（Ⅱb型）、浅表凹陷型（Ⅱc型）及联合型Ⅰ+Ⅱa、Ⅱa+Ⅱc、Ⅱc+Ⅲ等。目前人们把以上分型简化为三型即隆起型（相当于Ⅰ、Ⅱa、Ⅱa+Ⅱc）、平坦型（Ⅱb）、凹陷型（Ⅱc、Ⅲ、Ⅱc+Ⅲ、Ⅲ+Ⅱc）。组织学分型为：肠型（高、中分化，管状及乳头状腺癌）、弥漫型（低分化、未分化及印戒细胞癌）。Kitamura等报道早期胃癌淋巴结转移与组织学分型无明显相关性。
二、早期胃癌诊断
术前应对早期胃癌作出准确诊断，尤其明确以下几点：①病变位于粘膜或粘膜下；②内镜下大体形态；③是否多、原发；④组织学分型。应用电子内镜及内镜超声可较好地解决以上问题。尤其内镜超声可对病变浸润深度做出明确诊断，这对选择适当术式至关重要。通过内镜检查，早期胃癌检出率可提高15%。目前上消化道钡餐及双对比摄影诊断水平进一步提高，其诊断准确率与内镜检查无明显差别，且应用方便，适用于门诊病人的首次检查及早期胃癌的普查。
三、转移淋巴结的诊断
目前常用的诊断方法有内镜下淋巴结造影、腔内超声、同位素免疫定位、动态CT等。内镜淋巴结造影为经内镜将造影剂注入癌旁的胃壁内，然后经内镜行放射照相术，未转移的淋巴结显影良好，呈结节状，直径小于5mm；转移淋巴结边缘不规则显影，弥漫性肿大直径大于5mm。口服10%的油水乳剂后行内镜超声检查，可见其区域淋巴结显影，其诊断准确率为92%，特异性100%。动态CT诊断转移淋巴结的准确率为92%，稍高于一般CT。
四、淋巴结转移规律及病理临床分析
Kitamura等于1997年分析了634例早期胃癌的病理临床特征与淋巴结转移规律关系，发现肿瘤大小、浸润深度、淋巴管受累与淋巴结转移有显著关系。粘膜癌≤2cm、隆起型粘膜下癌≤1cm者无淋巴结转移。其它类型早期胃癌均有不同程度的转移。如阳性淋巴结数大小于5个或淋巴结转移超过肝总动脉水平者多伴有血性转移或腹膜播散。对这部分患者即使应用广泛淋巴结清除术也不提高生存率。Hamada等通过对大宗早期胃癌的病理临床特征分析发现，肿瘤大小、浸润深度及分化程度与淋巴结转移有关。并得出结论：凹陷型粘膜癌≤1cm、隆起型粘膜癌≤2cm、高分化者无淋巴结转移。综合各家报道作者认为，隆起型粘膜癌≤2cm、凹陷型粘膜≤1cm者无淋巴结转移，对这部分患者可施行局部手术。
五、早期胃癌局部切除术
在过去20多年里，早期胃癌的传统术式为“胃癌根2术式（R2）”，即根据肿瘤部位选择相应的治愈性胃次全切除加第1、2站淋巴结清除术。该术式虽可获得较好的治疗效果，但术后死亡率及并发症发生率高（如术后出血、吻合口漏或狭窄、胰漏、返流性食管炎、贫血、残胃癌等），生存质量差。大量的病理临床分析发现粘膜癌淋巴结转移率为0.6%-11%，第一站淋巴结转移率为0.7%-4.7%，第二站淋巴结转移率为0-2.4%。粘膜下癌淋巴结转移率为14.2%-26.8%，第一站淋巴结转移率为10.6%-18.9%，第二站淋巴结转移率为2.3%-8.9%。早期胃癌第三、四站淋巴结罕见有转移。同时发现在无淋巴结转移组，患者生存率与淋巴结清除范围成负相关。因此R2术式已不适合于所有早期胃癌患者。选择部分患者行局部切除术，可达到与R2术式相同的治疗效果，同时降低了术后并发症及死亡率。Kitamura等认为粘膜癌≤2.0cm、隆起型粘膜下癌≤1.0cm者即可行局部切除术不加淋巴结清扫。切除范围仍遵循“3cm原则”。这样在彻底治愈早期胃癌的同时，降低了术后死亡率及并发症，患者生存质量得到提高。
六、早期胃癌腹腔镜手术
应用腹腔镜切除早期胃癌是90年代兴起的一门新的治疗方法，日本学者称之为“腹腔镜胃内外科”。具体操作方法为将腹腔镜三个套针经腹壁置入腹腔，然后穿透胃壁进入胃腔行早期胃癌切除术。Ohagmi等应用腹貌合神离镜切除早期胃癌40例，切除标本面积为6.6±1.6cm×4.8±0.8cm，经组织学检查未发现癌残留。该方法具有以下优点：操作容易，创伤小，切除彻底，可详细进行组织学检查，同时对胃周可疑淋巴结可切除活检。应用腹貌合神离镜切除早期胃癌必须掌握以下适应症：粘膜癌、隆起型≤2.5cm、凹陷型≤1.5cm。术后定期内镜检查，密切随访。
七、早期胃癌内镜手术
内镜下切除早期胃癌始于80年代初期，首次应用于拒绝手术、患有严重并发症及高龄患者。随着早期胃癌检出率增加，尤其是粘膜癌增加，选择合适的病人行内镜下切除可达到完全治愈。常见的内镜切除法如下：①内镜下热探针切除法；②Nd-YAG激光切除法；③高频电流及微波切除法；④局部注射切除法。其中激光切除法应用较多，该法操作简单，切除彻底。热探针切除法可使局部创面凝固，止血效果好。局部注射切除法是在病灶边缘粘膜下注射生理盐水，使病灶隆起，然后用高频勒除器切除病灶。无论应用哪一种切除法，应遵循“2cm原则”，即标本缘距病灶边缘>2cm。Hamada等认为，标本切缘距病灶边缘>2cm为完全根治性切除，否则为不完全根治性切除。如标本切缘查见癌为非根治性切除，应再次应用局部切除或胃次全切除术，以保证治疗效果。
内镜下切除仅适用于无淋巴结转移的早期患者，Hiki认为隆起型粘膜≤2cm、凹陷型粘膜癌≤1.0cm为内镜下切除的绝对适应症。Sano等认为，凹陷型（无壁内溃疡）和隆起型粘膜癌≤1.5cm、高分化为内镜下切除的适应症。切除范围应符合“2cm原则”，切除标本应详细进行组织学检查以确保治疗效果。
八、展望
随着影像学及内镜检查诊断水平的提高，早期胃癌尤其是粘膜癌、小胃癌、微小胃癌检出率的增加，所谓胃癌标准根治术式“R2术式”已受到挑战。早期胃癌手术模式正由大到小发生转化，局部切除、腹腔镜下切除及内镜下切除因其独特的治疗价值必将更多地应用于早期胃癌的治疗。
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